Dissertation/Thesis Abstract

Identification of Substrate Proteins of FtsH During Sporulation of Bacillus subtilis
by Nguyen, Hue Bach Thi, Ph.D., Universitaet Bayreuth (Germany), 2012, 100; 27610792
Abstract (Summary)

FtsH ist eine ATP- und Zn2+-abhängige Metalloprotease, welche mittels zweier Transmembran-Segmente in der cytoplasmatischen Membran verankert ist. Sie ist die einzige beschriebene Membran-verankerte AAA-Protease bei Bakterien mit verschiedenen regulatorische Funktionen. Eine ftsH-Knockout Mutante zeigt einen pleiotropen Phänotyp. Dazu gehören filamentöses Wachstum der Zellen, Sensitivität gegenüber einem Hitzeschock und osmotischen Schock, und die Zellen können nicht mehr sporulieren. Kürzlich konnten wir zeigen, dass ftsH-Knockout Zellen nicht das Sporulations-Stadium II erreichen aufgrund einer zu geringen Menge an Spo0A~P. Außerdem haben wir Spo0E, eine Spo0A~P-spezifische Phosphatase, als erstes Substrat von FtsH identifiziert. Da die Sporulationsfrequenz in einer spo0E ftsH Doppelmutante nur teilweise wiederhergestellt wird, vermuten wir, dass FtsH weitere Substratproteine abbaut, die die Sporulation negativ beeinflussen. Um weitere Proteine zu identifizieren, wurden zwei verschiedene Strategien angewendet. Mittels der 2D-Gel Technik wurden die Proteome einer ftsH Wildtyp- und einer ftsH-Knockout-Mutante miteinander verglichen. Es konnten eine Reihe von Proteinen identifiziert werden, die in Abwesenheit von FtsH entweder vermehrt oder reduziert produziert wurden. Eines der mengenmäßig etwa 4-fach erhöhten Proteine wurde als Spo0M identifiziert. Da ftsH nicht mit der Transkription von spo0M interferiert, wurde ein in-vitro-Proteolysetest mit gereinigten Komponenten etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass Spo0M ATP- und Zeit-abhängig von FtsH abgebaut wird. In der zweiten Strategie wurde zunächst eine ftsHtrap Mutante konstruiert und auf Verlust der Proteolyse-Aktivität getestet. Protease Trap-Mutanten sind noch in der Lage ihre Substrate zu binden, können diese aber nicht mehr abbauen. Mit Hilfe einer GST- ftsHtrap Mutante konnte das Membran-Protein YwnF gebunden und dann mittels Massen-Spektrometrie identifiziert werden. Weitere Experimente sind notwendig, um YwnF als Substrat-Protein zu verifizieren. Der letzte Teil der Dissertation galt dem eag-Gen, welches mit spo0E ein bicistronisches Operon bildet. Die Konstruktion und Analyse einer eag Insertions-Mutante ergab einen leichten Anstieg in der Sporulationsfrequenz und in der Menge an Spo0A. Eine Transkriptionsfusion zwischen dem Promotor des spo0E-eag Operons und dem lacZ Reportergen zeigte einen Anstieg in der beta-Galactosidase Aktivität ab t0 bei Wachstum der Zellen in Sporulationsmedium. Da es sich bei Eag vermutlich um ein integrales Membranprotein handelt, kann es überschüssige Mengen an Spo0E binden und dadurch eine Dephosphorylierung von Spo0A~P verhindern. Alternativ oder zusätzlich kann Eag Spo0E binden und es FtsH als Modulatorprotein zum Abbau präsentieren

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Advisor:
Commitee:
School: Universitaet Bayreuth (Germany)
School Location: Germany
Source: DAI-C 81/4(E), Dissertation Abstracts International
Source Type: DISSERTATION
Subjects: Biology
Keywords: Double mutant strain, Sporulation medium, Membrane protein
Publication Number: 27610792
ISBN: 9781392619650
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