Dissertation/Thesis Abstract

Exploring the Microbiome of the Mediterranean Sponge Aplysina aerophoba by Single-Cell and Metagenomics
by Slaby, Beate Magdalena, Ph.D., Bayerische Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg (Germany), 2017, 132; 10664597
Abstract (Summary)

Schwämme (Phylum Porifera) sind evolutionär alte, sessile Filtrierer, die eine äußerst vielfältige mikrobielle Gemeinschaft in ihrer internen Mesohylmatrix beherbergen. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, die Anpassungen dieser Symbionten an das Leben in ihrem Schwammwirt zu erforschen. Dazu habe ich die Genome einer Vielzahl von Bakterien aus dem Mikrobiom des Mittelmeer-Schwammes Aplysina aerophoba sequenziert und analysiert. Meine angewandten Methoden waren die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit anschließender so genannter „multiple displacement amplification“ und Einzelzell- / „Mini-Metagenom“-Sequenzierung und metagenomischer Sequenzierung gefolgt von „differential coverage binning“. Diese beiden Ansätze zielten darauf ab, Genomsequenzen von bakteriellen Symbionten von A. aerophoba zu erhalten, die dann sowohl miteinander, als auch mit Referenzen aus anderen Habitaten verglichen wurden. So sollten Informationen gewonnen werden über Anpassungen an ein Leben im Wirtsschwamm und über mögliche Interaktionen mit dem Wirt und innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft.

Cyanobakterien sind häufig Mitglieder der bakteriellen Gemeinschaft in Schwämmen. Mein "Mini-Metagenom"-Sequenzierprojekt lieferte drei Genom-Entwürfe von „Candidatus Synechococcus spongiarum,“ dem cyanobakteriellen Symbionten von A. aerophoba und vieler weiterer Schwämme, die die photische Zone bewohnen. Das vollständigste dieser Genome wurden mit anderen Kladen dieses Symbionten verglichen und mit nah verwandten, freien lebenden Cyanobakterien-Referenzen in Burgsdorf I *, Slaby BM * et al. (2015; * geteilte Erstautorenschaft). Obwohl die vier Kladen von „Ca. Synechococcus spongiarum“ aus den vier Schwammarten A. aerophoba, Ircinia variabilis, Theonella swinhoei und Carteriospongia foliascens auf der Ebene der 16S-rRNA-Gensequenzen zu etwa 99% identisch waren, unterschieden sie sich deutlich auf Genom-Ebene. Nicht nur die Genomgrößen waren von Klade zu Klade verschieden, sondern auch der Gengehalt und eine Reihe von Merkmalen, einschließlich Proteinen mit genannten „eukaryotic-like domains,“ leucinreiche „repeats“ oder Tetratricopeptid-„repeats“. Auf der anderen Seite teilten die vier Kladen eine Reihe von Merkmalen wie Ankyrin-„repeat“-Domänen-haltige Proteine, die auch in anderen Phyla von Schwammsymbionten in verschiedenen Wirtsschwämmen und aus verschiedenen geografischen Orten konserviert zu sein schienen. Ein möglicher neuartiger Mechanismus zur Phagozytose-Vermeidung und zur Phagenresistenz mittels eines veränderten O-Antigens des Lipopolysaccharids wurde identifiziert.

Um vorherige Hypothesen über die Anpassung von Schwamm-assoziierten Bakterien auf ein breiteres Spektrum des Mikrobioms von A. aerophoba zu testen und gleichzeitig in der Methodik voran zu schreiten, entwickelte ich einen bioinformatischen Arbeitsablauf, um metagenomische Illumina-„short-read“-Sequenzdaten mit PacBio-„long-reads“ zu kombinieren. Zu Beginn dieses Projektes gab es keine veröffentlichte Methodik zur Verknüpfung von „short-reads“ und „long-reads“ für die Metagenomik, und auch jetzt gibt es keine veröffentlichten Projekte mit einem vergleichbaren Ziel von nicht-gezieltem „Assembly“, „Binning“ und Analyse eines Metagenoms. Ich habe eine Auswahl von „Assembly“-Programmen und Einstellungen auf einem simulierten Testdatensatz getestet, der die Eigenschaften der realen metagenomischen Daten widerspiegelt. Die entwickelte „Assembly“-Methode verbesserte nicht nur die Gesamtstatistik, sondern auch die Qualität der einzelnen, „gebinnten“ Genome, die durch Vergleich zu den ursprünglich veröffentlichten Genom-Sequenzen evaluiert wurde.

Das Mikrobiom von A. aerophoba wurde in den letzten Jahren aus verschiedenen Blickwinkeln untersucht, aber nur Genome des Candidatus-Phylum Poribakterien und die Cyanobakteriensequenzen aus meinem oben beschriebenen Projekt wurden bisher veröffentlicht. Durch die Anwendung meiner neu entwickelten „Assembly“-Methodik auf einen metagenomischen Datensatz von A. aerophoba bestehend aus einem PacBio-„long-read“-Datensatz und sechs Illumina-„short-read“-Datensätzen, die für das anschließende „differential coverage binning“ optimiert waren, zielte ich darauf ab, eine größere Anzahl und Vielfalt von Symbionten zu sequenzieren. Die Ergebnisse dieses Projektes sind derzeit bei The ISME Journal in Review. Die Komplementierung von Illumina „short-read“ mit PacBio „long-read“-Sequenzdaten für das „binning“ dieses hochkomplexen Metagenoms hat die Gesamt-„assembly“-Statistik sowie die Qualität der „gebinnten“ Genome deutlich verbessert. Siebenunddreißig Genome aus 13 Bakterienphyla und Candidatus-Phyla wurden „gebinnt“, die die prominentesten Mitglieder des Mikrobioms von A. aerophoba darstellten. Ein statistischer Vergleich zeigte eine Anreicherung von Genen, die mit Restriktionsmodifikationen und Toxin-Antitoxin-Systemen zusammenhängen, in den meisten Symbionten-Genomen im Vergleich zu ausgewählten Referenzgenomen. Beides sind Mechanismen zur Verteidigung gegen eindringende Fremd-DNA, die für Schwamm-Symbionten aufgrund der Schwamm-Filtration und Phagozytose-Aktivität wichtig sein können, die die Symbionten hohen Konzentrationen von freier DNA aussetzen. Auch mögliche Wirtskolonisations- und Matrixnutzungsmechanismen waren signifikant angereichert. Wegen der Vielfalt der „gebinnten“ Symbionten-Genome war ein Genom-Vergleich innerhalb der Symbionten möglich, der drei Gilden von Symbionten zum Vorschein brachte, die gekennzeichnet waren durch i) Ernährungsspezialisierung auf die Metabolisierung von Carnitin, ii) Spezialisierung auf sulfatierte Polysaccharide und iii) scheinbaren Nahrungs-Generalismus. Sowohl Carnitin als auch sulfatierte Polysaccharide sind in der extrazellulären Schwammmatrix reichlich vorhanden und stehen so den Schwammsymbionten als Substrat zur Verfügung. Die Genome der diversen Symbionten-Gemeinschaft in A. aerophoba waren in ihren Verteidigungsmechanismen vereint, aber spezialisiert hinsichtlich ihrer Ernährung.

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Advisor: Hentschel Humeida , Ute , Dandekar , Thomas , Partensky , Frédéric , Keller , Alexander
Commitee:
School: Bayerische Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg (Germany)
School Location: Germany
Source: DAI-C 81/5(E), Dissertation Abstracts International
Source Type: DISSERTATION
Subjects: Aquatic sciences
Keywords: Aplysina aerophoba
Publication Number: 10664597
ISBN: 9781392377024
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