Dissertation/Thesis Abstract

Characterization of Novel Rhodopsins with Light-Regulated cGMP Production or cGMP Degradation
by Tian, Yuehui, Ph.D., Bayerische Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg (Germany), 2018, 122; 27657197
Abstract (Summary)

Photorezeptoren sind in fast allen Lebewesen vorzufinden. Sie vermitteln den ersten Schritt bei der Detektion von elektromagnetischer Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge. Ihre Absorptionsspektren finden sich innerhalb des Bereichs der stärksten Sonnenstrahlung (UV bis nahes IR) und die Absorption löst normalerweise nachgelagerte Signalwege aus. Bis jetzt sind hauptsächlich 6 Klassen von Photorezeptoren bekannt: als wasserlösliche Proteine zunächst drei Klassen von Blaulicht-empfindlichen Modulen, die LOV-Domäne (Light/Oxygen/Voltage), die BLUF-Domäne (Blue Light sensing, Using FAD) und Cryptochrom mit Flavinen (Vitamin B-Komplex) als Chromophor, sowie Xanthopsine, die hauptsächlich für gelbes Licht und Phytochrome, die für Rotlicht empfindlich sind. Als integrale Membranproteine kann die Klasse der Rhodopsine jedoch ein breiteres Absorptionsspektrum aufweisen, je nach Rhodopsin empfindlich für UV/blaues, grünes oder sogar rotes Licht. Rhodopsine bestehen aus dem Protein Opsin und dem kovalent gebundenen Chromophor Retinal (Vitamin A-Aldehyd). Sie können weiter in zwei Typen unterteilt werden, mikrobielle (Typ I) und tierische (Typ II) Rhodopsine. In dieser Dissertation konzentriere ich mich auf die Identifizierung und Charakterisierung von neuen Typ I Opsinen mit Guanylylcyclase-Aktivität aus Grünalgen und einem Phosphodiesterase-Opsin aus dem Protisten Salpingoeca rosetta.

Bis 2014 wiesen alle bekannten Rhodopsine eine typische Struktur mit sieben Transmembranhelices (7TM), einem extrazellulären N-Terminus und einem zytosolischen C- Terminus auf. Die nachgewiesene Funktion der experimentell charakterisierten Rhodopsine vom Typ I ist der Membrantransport von Ionen oder die Kopplung an einen Transducer, der die Phototaxis über eine Signalkette ermöglicht. Eine völlig neue Klasse von Typ-I Rhodopsinen mit enzymatischer Aktivität wurde 2014 gefunden. Ein lichtaktiviertes Guanylyl-Cyclase- Opsin wurde im Pilz Blastocladiella emersonii (Be) entdeckt, das von Gao et al. (2015) nach heterologer Expression und gründlicher in-vitro-Charakterisierung Cyclop (Cyclase opsin) genannt wurde. BeCyclop ist das erste Opsin, für das eine Struktur mit 8 Transmembranhelices (8TM) demonstriert wurde (Gao et al., 2015). Bereits früher (2004) wurde durch expressed sequence tag (EST) und Genom-Daten vorhergesagt, dass eine neue Klasse von enzymatischen

Rhodopsinen in Chlamydomonas reinhardtii existiert, jedoch gelang bisher keine funktionelle Expression. Eines dieser hypothetischen Rhodopsine umfasste eine N-terminale Opsin- Domäne, ein fusioniertes Zweikomponentensystem mit Histidinkinase- und Regulator-Domäne und eine C-terminale Guanylylcyclase (GC). Dies legte nahe, dass das Protein eine biochemische Signalkaskade inkorporieren könnte, die Licht-Absorption und ATP-abhängigen Phosphattransfer integriert und eine lichtempfindliche cGMP-Produktion bewirkt.

Eines meiner Projekte konzentrierte sich auf die Charakterisierung von zwei solchen Opsinen aus den Grünalgen C. reinhardtii und Volvox carteri, die wir nun 2c-Cyclop (Zweikomponenten-Cyclase-Opsin), d.h. Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop, nennen. Meine Ergebnisse zeigen, dass beide 2c-Cyclops durch Licht gehemmte GCs sind. Interessanterweise sind Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop sehr empfindlich gegenüber Licht und die cGMP- Produktion ist ATP-abhängig, wobei die Wirkungsspektren von Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop bei ~540 nm bzw. ~560 nm ihren Höhepunkt erreichen. Ich konnte zeigen, dass die Guanylyl- Cyclase-Aktivität von einem kontinuierlichen Phosphat-Transfer zwischen Histidinkinase und Response-Regulator abhängt. Grünes Licht kann jedoch den Phosphoryl-Gruppen-Transfer dramatisch blockieren und die Cyclase-Aktivität inhibieren. Dementsprechend führte die Mutation des Retinal-bindenden Lysins in der Opsindomäne zu einer cGMP Produktion ohne jegliche Lichtinhibierung.

Eine neuartige Rhodopsin-Phosphodiesterase aus dem Protisten Salpingoeca rosetta (SrRhoPDE) wurde im Jahr 2017 entdeckt. Die vorangegangenen zwei Studien von 2017 zeigten jedoch eine sehr schwache oder fehlende Lichtregulation der PDE-Aktivität. Hier konnte ich eine starke Lichtregulation beweisen, indem ich die Aktivität von SrRhoPDE, exprimiert in Xenopus laevis Oozyten, in-vitro bei verschiedenen cGMP-Konzentrationen untersuchte. Überraschenderweise zeigt die Hydrolyse von cGMP einen etwa 100-fach höheren Umsatz als der von cAMP. Licht kann die Substrataffinität durch Verringern des Km-Werts für cGMP von 80 µM auf 13 µM erhöhen, erhöht jedoch den maximalen Umsatz nur um ~30%. Darüber hinaus können zwei Einzelmutanten, SrRhoPDE K296A oder K296M, den Lichtaktivierungseffekt aufheben, indem sie eine kovalente Bindung vom Schiff-Base-Typ an

das Chromophor Retinal unterbrechen. Ich zeige auch, dass SrRhoPDE zytosolische N- und C-Termini aufweist, höchstwahrscheinlich über eine 8-TM-Struktur. In Zukunft könnte SrRhoPDE ein potentiell nützliches optogenetisches Werkzeug für die Lichtregulation der cGMP-Konzentration sein, möglicherweise nach weiteren Verbesserungen durch Gentechnik.

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Advisor: Nagel , Georg
Commitee:
School: Bayerische Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg (Germany)
School Location: Germany
Source: DAI-C 81/4(E), Dissertation Abstracts International
Source Type: DISSERTATION
Subjects: Botany
Keywords: Rhodopsins
Publication Number: 27657197
ISBN: 9781392782224
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