Dissertation/Thesis Abstract

Characterisation of the Mitotic Kinesin 13-1 in Trypanosoma brucei
by Riemer, Anna, Dr.Nat., Universitaet Bayreuth (Germany), 2018, 184; 27600401
Abstract (Summary)

Trypanosoma brucei ist ein einzelliger Parasit, der eine Flagelle besitzt. Er verursacht südlich der Sahara die afrikanische Trypanosomiasis, die allgemein als Schlafkrankheit bekannt ist. Eine anspruchsvolle Aufgabe beim Bekämpfen dieser Krankheit ist es, neue Medikamente zu finden, die ohne schwerwiegende Nebenwirkungen für den Patienten sowie einfach zu verabreichen sind. Diese Arbeit betrachtet das mitotische Kinesin TbKif13-1 als ein potentielles Angriffsziel für Medikamente. Es wurde versucht, die Vorraussetzungen für eine in vivo und eine in vitro Suche nach einem TbKif13-1 Inhibitor im Hochdurchsatz mit automatisierter Bildanalyse zu schaffen. Die Grundlage beider Analysemethoden war die durch TbKif13-1 vermittelte Depolymerisation von Mikrotubuli und deren Verhinderung durch einen passenden Inhibitor. Im in vivo Versuchsaufbau diente das Mikrotubulizytoskelett von HeLa Zellen in Interphase als Substrat. Die Vorraussetzung für diesen Versuch war eine stabile HeLa Zelllinie, die nach der induzierten Überexpression von eGFPTbKif13-1 S143A ein depolymerisiertes Zytolskelett aufweist. Die eingebrachte Mutation verhinderte dabei seine Inhibition durch Phosphorylierung. Die Grundidee funktionierte in transient transfizierten HeLa Zellen. Allerdings zeigten die erzeugten stabilen Zelllinien keine Depolymerisation des Mikrotubulizytokeletts nach eGFPTbKif13-1 S143A Überexpression. Im in vitro Versuchsaufbau dienten T. brucei Zytoskelette als Depolymerisationssubstrat für rekombinant aufgereinigtes His6TbKif13-1. Dieser Versuch funktionierte gut auf Objektträgern. Jedoch funktionierte er nicht auf den vorausgesetzten 384-well Platten. In dieser Arbeit wurden TbKif13-1 Domänen funktionell charakterisiert, indem TbKif13-1 Deletionskonstrukte in in vivo und in in vitro Versuche eingesetzt wurden. Immunfluoreszenz-Studien zeigten, dass die intranukleäre TbKif13-1 Lokalisation von einem Gleichgewicht verschiedener NLS und NES abhängt, mit der stärksten NLS im C-Terminus. TbKif13-1 wurde Proteasom-abhängig abgebaut und war in G1 Zellen nicht zu finden. Abbausignale wurden im N- und C-Terminus vermutet. TbKif13-1, in seiner vollen Länge, band in mitotischen Zytoskelettproben in einer Form, die an die mitotische Spindel erinnert. In vitro band es an Taxol stabilisierte Mikrotubuli und depolymerisierte diese ATP abhängig. Die neck-motor Domäne in Verbindung mit dem C-Terminus erwies sich als das minimal funktionelle Konstrukt für das Binden an und das Depolymerisieren von Mikrotubuli in vitro. Der entkoppelte Mechanismus von Depolymerisation und ATPase Aktivität ist in TbKif13-1 konserviert. Die ektopische Expression des TbKif13-1 in seiner vollen Länge führte zu reduziertem Wachstum, der Ausbildung von Zoiden und Defekten in der Ausbildung der Spindel. Dieser dominant-negative Phänotyp war am stärksten nach der ektopischen Expression der neck-motor Domäne ausgeprägt. Eine erwartete inhibierende Regulation der Depolymerisationsaktivität von TbKif13-1 durch eine TbAuk1-vermittelte Phosphorylierung konnte nicht bestätigt werden.

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Advisor:
Commitee:
School: Universitaet Bayreuth (Germany)
School Location: Germany
Source: DAI-C 81/4(E), Dissertation Abstracts International
Source Type: DISSERTATION
Subjects: Pharmacology, Organic chemistry
Keywords: Microtubule depolymerisation, Trypanosomiasis
Publication Number: 27600401
ISBN: 9781687900906
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